试管婴儿植入遗传学诊断单细胞PCR方法
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聚合酶链式反应(polymerase chain。
在PCR基础上衍生的一些扩增技术已用于基因突变的诊断,由于其可使特定DNA片段在数量上呈指数增加至可检测范围,是近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术,目前单基因疾病PGD所用的方法主要是基于PCR技术通过检测单细胞靶基因的数目及结构有无异常加以诊断,故成为基因诊断的重要方法,reaction,PCR)简称PCR技术。
单细胞PCR无需抽提DNA,即进行PCR循环反应,与经典PCR相比,其优点是无需制备DNA,经过变性前处理步骤后,节省时间,从获得样本、。
故PCR体系必须具备下列条件：①对模板扩增的忠实性好,③无非特异性扩增,④扩增的灵敏度高,②方法稳定,目前用于PGD的PCR方法主要有以下几种：,但由于单细胞PCR的模板量极低,PCR反应到出结果只需几个小时左右,仅1–2拷贝。
1．巢式
只有初级PCR中特异的扩增片段才可能被二级引物扩增,从而提高了扩增特异性,可减少引物与模板非特异性位点的复性、引物二聚体的形成以及非特异背景产物的产生,巢式引物被应用,巢式PCR设置二步PCR,为了既不影响特异性又获得较大的敏感性,而且增加了最终产物量,由于单细胞中可检测的仅l一2个拷贝的基因序列。
2．多重
这些基因常多处发生缺失或突变,如果与疾病相关的基因十分庞大,而且这些改变发生在相邻十至数百个,如杜氏肌营养不良症(DMD),有2000多kb长。
超出了PCR技术所能扩增的有效长度,目前报道多重PCR反应最多可同时扩增12条区带,扩增同一模板的几个区域,可采用多重PCR,kb的距离,对此,既在同一试管中加人多对引物。
3．荧光
PCR产物用激光分析系统进行分析,从产物大小到核苷酸序列都能够被准确分析,在片段分析结构系统中,指荧光标记的寡核苷酸引物,相同大小的不同产物可以被区分开,由于不同的荧光分子在激光激发下有不同波长,对于单细胞35–4O个循环就可以产生足够量的产物,其敏感性优于普通PCR千倍,准确性可达l一2bp,不仅减少了散在的、非特异的污染,而且缩短诊断时间,现该方法已广泛用于PGD。
还有一条荧光标记探针,4．荧光定量PCR该技术融汇了PCR和DNA探针杂交技术的优点,这条探针的5’和3’端分别标记了荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q),释放出荧光信号,且信号的强弱与,PCR开始后,不仅有两条普通的引物,当探针保持完整时,Taq酶将荧光探针切断,反应体系中,无荧光发出,随着链的延伸。
PCR的产物数量成正比,检测出前者可计算出后者,从而获取DNA模板的准确结果,该技术在完全闭管的情况下进行,无需凝胶电泳,通过特殊探头直接探测。
PCR过程中荧光信号的变化,解决了常规PCR不能定量及扩增产物污染而导致的假阳性、操作复杂等问题,减少污染的可能性,提高了诊断的效率。
5．原位
但这种新方法有效的把原位杂交技术的细胞定位能力与PCR扩增的所有潜在敏感性结合起来,该方法也许会成为PGD的未来,先用PCR原位扩增,相信随着引物设计及荧光PCR与原位PCR有效的结合,目前PGD中应用该方法,PCR的有效率为65％,其不足会得到克服,遗憾的是ADO较常规PCR高,此技术由HaSSe等于1990年建立,即在固定于同一载玻片上的同一个单细胞上,再用FISt{检测,FISI–I达85％。
6．免疫
检测突变的特异性探针用地高辛标记,该法已用于囊性纤维病基因突变的检测,通过显色来鉴定突变是否存在,根据显色深浅可做定量分析,利用了PCR的大量扩增能力和抗原抗体反应的特异性,其原理是将目的基因的扩增产物用生物素标记,是PCR法与酶联免疫吸附试验(ELISA)法的融合技术,二者经变性退火处理后加到含抗生物素的酶标板内。